Производители микроскопов помещают в центр внимания все более крупные биологические объекты

Микроскопия до сих пор была компромиссом: чем больше образец, тем ниже разрешение.

Долгосрочная функциональная визуализация эмбриона дрозофилы , снятая с помощью световой микроскопии на. Предоставлено: Рагхав Четри и Филипп Келлер / HHMI, Исследовательский кампус Janelia

В солнечном офисе на третьем этаже исследовательского кампуса Janelia в Медицинском институте Говарда Хьюза в Эшберне, штат Вирджиния, Филипп Келлер демонстрирует оптику для своего новейшего микроскопа. Но смотреть, пока, особо не на что…

«То, что у нас сейчас есть, — говорит Келлер, указывая на экран своего компьютера — По сути, это стеклянные плиты, извлеченные из печи с непрерывным потоком».

Плиты напоминают ледяные глыбы размером с книгу, стоящие словно на библиотечной полке. Келлер, надеется использовать их для создания нового типа микроскопа, способного достигать высокого разрешения и способного обрабатывать образцы такого размера, которые уже давно находятся в списке желаний биологов.

В биологической микроскопии, по его словам, исследователи могут либо смотреть на большие образцы в низком разрешении либо на маленькие образцы в высоком разрешении. На самом деле не было возможности взглянуть на образцы — размером более одного кубического миллиметра — и выделить клетки или даже более мелкие детали. «Обычно это компромисс», — говорит он. Единственный способ объединить оба варианта — это создать некий массив листов, в котором вы берете крошечный объем изображения и просто растрируете его по всей выборке в 3D» — трудоемкий и вычислительно требовательный процесс.

Исследователи все чаще разрабатывают «мезоскопы» — мезомасштабные микроскопы — чтобы обойти эту проблему. Эти приборы могут фиксировать клеточные и даже субклеточные процессы в образцах, размер которых может превышать один сантиметр. Полученные наборы данных обеспечивают беспрецедентную перспективу. Как говорит Гейл Макконнелл, физик из Университета Стратклайда в Глазго, Великобритания, который разработал один такой мезоскоп: «Это почти макросъемка, но с более высоким разрешением».

Биологическая микроскопия — это компромисс. Например, чтобы ускорить процесс, исследователи, как правило, захватывают много изображений в быстрой последовательности с коротким временем экспозиции. Поэтому образец должен быть очень ярким, чтобы обеспечить как можно больше фотонов за доступное время. Это требует больше входной световой энергии, которая может убить (или, по крайней мере, отбелить) образец. В результате такая визуализация не может быть долговременной.

Большие цели

Аналогично, системы, которые могут захватывать мелкие клеточные детали, как правило, имеют узкое поле зрения. Точечные сканирующие конфокальные микроскопы создают четкие изображения субклеточных структур путем сканирования плотно сфокусированного лазерного луча через образец, возбуждая флуоресценцию в образце пиксель за пикселем.

По словам Макконнелла, такая визуализация «невероятна для очень маленьких объемов ткани», но ее нельзя применять к крупным образцам, таким как мышиные эмбрионы поздней стадии, «из-за низкой числовой апертуры линзы с малым увеличением», которая была бы необходима для таких больших образцов. Числовая апертура (NA) относится к способности линзы захватывать свет; более высокий NA обычно соответствует большему увеличению и более короткому рабочему расстоянию между линзой объектива и образцом.

Чтобы преодолеть эту проблему, Макконнелл объединился с разработчиком конфокальной микроскопии Брэдом Амосом, также в Strathclyde, для создания объектива макроскопического масштаба с необычным сочетанием высокого NA и низкого увеличения, способного обеспечить как широкое поле зрения, так и высокую пространственную детализацию. Результатом является «Mesolens», обычное оптическое устройство, которое может отображать изображение в поле зрения шириной 6 миллиметров с разрешением 0,7 микрометра в поперечном и 5 микрометров в осевом направлении и рабочим расстоянием 3 мм — достаточным для различения объектов, которые составляют примерно одну десятую диаметра типичной клетки млекопитающего.

Световые микроскопы используют низкоинтенсивные лазеры для изучения живой ткани в течение длительных периодов времени. Предоставлено: Рагхав Четри, Мэтт Стейли и Филипп Келлер / HHMI, Исследовательский кампус Janelia

Мезолены выглядят как линза объектива на стероидах: «Я бы сравнил их примерно с той же длиной и шириной, что и рука взрослого человека», — говорит Макконнелл. Потребовалось десятилетие, чтобы построить, и его чистый размер — его стеклянные элементы почти в три раза больше диаметра типичного объектива микроскопа — делает его несовместимым со многими готовыми компонентами, отмечает Макконнелл. «Допуск, с которым они должны быть отшлифованы и отполированы — — не говоря уже о выравнивании относительно друг друга — становится намного более жестким», чем с обычными линзами, говорит она.

Подходящие детекторы тоже были проблемой. По ее словам, одной из причин, по которой Макконнелу и Амосу понадобилось так много времени, чтобы построить мезолинзы, было то, что им пришлось ждать широкополосных датчиков, которые могли бы захватывать полученные фотоны. Амос стал соучредителем дочерней компании по коммерциализации мезолинс, но «на данный момент мы не находимся в коммерческом пространстве», — говорит Макконнелл (который не имеет доли в компании). «Мы работаем над рецептом линз, который, надеюсь, будет легче сделать».

Тем не менее, команда Макконнелла использовала свой дизайн, чтобы начать решать биологические вопросы, включая архитектуру бактериальных биопленок, которые представляют собой коллекции микробов, которые растут на поверхности внутри пленки, которую они выделяют, и которые часто связаны с болезнью. «Мы видим новые и появляющиеся свойства этих биопленок, которые потенциально могут помочь нам узнать о борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам», — говорит она.

Ционхай Дай, специалист по информатике в Университете Цинхуа в Пекине, также занимается проблемой получения изображений в сантиметровом масштабе. Признавая огромный разрыв между микроскопией высокого разрешения и методами макро-масштаба, такими как функциональная магнитно-резонансная томография и компьютерная томография, команда Дая приступила к разработке гигапиксельного микроскопа с высоким пространственно-временным разрешением, говорит Линджи Конг, физик из лаборатории.

Результатом этой работы является RUSH, прибор с настраиваемым объективом, изогнутым массивом из 35 камер и вычислительной системой, которая может захватывать и анализировать данные в режиме реального времени. В то время как Mesolens может производить данные примерно в 4 миллиона пикселей в секунду, говорит Конг, RUSH производит 5,1 миллиарда, отображая поле зрения 10 × 12 мм2 со скоростью 30 кадров в секунду. Этого достаточно, чтобы запечатлеть всю поверхность головного мозга мыши в одном кадре и разрешить отдельные субклеточные органеллы, называемые митохондриями.

Команда Дэя использовала свою систему для отслеживания флуоресцентно меченных клеток крови, перемещающихся по поверхности мозга мыши, и для мониторинга нейронной активности в свежеприготовленных срезах человеческого мозга. Планируются исследования на нечеловеческих приматах. По словам Конга, в разработке находится второе поколение RUSH с более высоким разрешением и пропускной способностью данных, а также коммерческая версия прибора. «Ожидается, что он будет доступен к следующему году».

Зеркало к зеркалу

Для решения сложных задач команда Келлера обратилась к астрономии. Большие телескопы используют зеркала, потому что они легче и их легче изготавливать, чем линзы. Зеркала также не имеют многих аберраций, которые могут ухудшить производительность, когда линзы становятся больше. Так почему же никто не использовал их для создания микроскопа? «Если честно, я не знаю точно, почему они этого не сделали», — признает Келлер.

Его команде не привыкать к нестандартным микроскопам. За последнее десятилетие компания разработала ряд все более сложных систем «световых листов», в которых плоскость лазерного излучения низкой интенсивности проецируется через образец. Изображения снимаются сбоку (то есть под углом 90 градусов к плоскости света), чтобы максимально увеличить время визуализации и минимизировать фотоповреждение. Эти микроскопы, собранные на оптических верстаках, которые доминируют в небольших комнатах в лаборатории Келлера, могут записывать клеточную динамику и нейронную активность развивающихся плодовых мух и рыбок данио в течение нескольких часов.

В октябре 2018 года Кейт Макдол, ученый-исследователь из группы Келлера, описала комбинированный микроскоп и конструкцию экологической камеры, которая увеличила этот период до двух дней. Она использовала его в гораздо более сложной теме: в сочетании с мощным набором специального программного обеспечения для анализа она смогла получить изображение и отследить каждую клетку эмбриона мыши в течение 48 часов. За это время эмбрион увеличивается в объеме в 250 раз.

Настраиваемые микроскопы обеспечивают исключительную гибкость, но не всегда просты в использовании. Макдол считает, что только семь из десяти экспериментов доходят до логического завершения. Иногда микроскоп плохо себя ведет, а иногда и образец. Иногда резервуар с углекислым газом, необходимый для поддержания роста животного, отключается, а иногда компьютерная система микроскопа решает обновить его во время эксперимента, — говорит она. «Мерфи» — как в законе Мерфи — «ходит за мной по пятам, как щенок», — шутит Макдол.

Ключевым элементом находящегося в разработке лабораторного проекта «Зеркальный микроскоп», возглавляемого инженером-оптиком Дэном Фликкингером и молодым ученым Бенкуаном Вангом, является вогнутое зеркало длиной 168 мм, которое, по словам Келлера, стоит около 6000 долларов США. По словам Келлера, система с полем зрения 14 × 14 мм2 , высоким коэффициентом полезного действия 1,0 и массивом детектирования, состоящим из десятка камер, должна захватывать примерно в 200 раз больше образца, чем большинство коммерческих микроскопов, и в то же время различать субклеточные детали.

Работая с другой командой в Janelia, он надеется использовать зеркальную систему для захвата нейронных связей или «коннектом» всего мозга мыши. И он надеется записать активность мозга нескольких рыбок данио одновременно, когда они взаимодействуют и плавают в ограниченном пространстве. По словам Келлера, наборы данных могут занимать петабайты, что эквивалентно тому, что его команда в настоящее время генерирует за год. По словам Макдол, первый набор данных для мыши составлял 20 терабайт, и «и он сломал каждую часть программного обеспечения для обработки изображений, которое у нас было».

Однако сначала команде придется показать, что дизайн работает. Предварительные испытания начнутся в этом месяце (ноябрь 2019 ред.) «Я уверен, что к концу года у нас будет первое изображение, которое было сформировано с помощью полностью зеркальной системы обнаружения», — говорит Келлер.

Два фотона лучше, чем один

Световая микроскопия лучше всего подходит для относительно прозрачных образцов. Более непрозрачные образцы требуют других методов, и исследователи добиваются прогресса в их применении и к большим полям зрения.

В 2016 году команды во главе с разработчиками микроскопии Фритьофом Хельмхеном в Цюрихском университете в Швейцарии, Спенсером Смитом, затем в Университете Северной Каролины, Чапел-Хилл и Карелом Свободой в Janelia, независимо друг от друга, описали инновационные «двухфотонные» микроскопы, которые могут отображать макромасштабные образцы. В этих устройствах используются сверхбыстрые длинноволновые лазерные импульсы, которые возбуждают флуоресценцию в образце, но только в четко определенной плоскости. Полученные изображения имеют высокую контрастность до 1 мм в глубину, но охватывают только около 1 мм2. Система Svoboda, называемая мезоскопом 2p-RAM, обеспечивает поле зрения 5 × 5 мм2 — достаточно, чтобы охватить всю поверхность мозга мыши. Системы Хельмчена и Смита, изображение 1,8 × 1,8 мм2 и более 9,5 мм2 соответственно.

Поле зрения прибора 2p-RAM (оранжевое) может одновременно получить доступ к большей части мозга мыши. Предоставлено: Nick Sofroniew и Karel Svoboda.

Свобода говорит, что когда дело идет о больших размерах, недостаточно просто увеличить масштаб цели; необходимо реинжинирировать несколько частей, чтобы учесть, как свет распространяется через такую оптику. Фактически, причина, по которой его команда остановилась на фокусе в 5 × 5 мм2, говорит он, заключается в недоступности больших детекторов: “5 мм — сейчас это предел, если вы, конечно, не хотите выбрасывать много сигнала. В этом бизнесе мы ненавидим так делать», — говорит он.

Такие системы позволяют нейробиологам увидеть лес за деревьями. Попытка декодировать нейронную коммуникацию, изучая одну область мозга за один раз, говорит Свобода, подобна концентрации только на одной секции оркестра. Но с большими полями зрения, «хороший кусок корковой поверхности мыши» становится открытым для изучения. Нейроны мерцают подобно зернистым светлячкам в оттенках серого, и, отслеживая эти вспышки с течением времени, исследователи могут определить корреляции между клетками, связями и более крупными областями мозга. «Теперь мы можем исследовать то, что мы называем мультирегиональными схемами или мультирегиональными взаимодействиями в реальном времени».

Система 2p-RAM была лицензирована Thorlabs, поставщиком микроскопии в Стерлинг, штат Вирджиния. Один из первых коммерчески доступных инструментов был приобретен нейробиологом Маккензи Матисом из Гарвардского университета в Кембридже, штат Массачусетс. На ежегодной конференции Общества нейробиологии в прошлом месяце в Чикаго, штат Иллинойс, Матис представила данные на собрании группы пользователей Thorlabs, показывающие, что она может использовать эту систему, а также некоторое домашнее программное обеспечение для глубокого обучения, для изучения мышей, взаимодействующих с видео игрой. «Тяги джойстика можно точно расшифровать от нервной деятельности», — сказала она аудитории.

RAM в 2p-RAM означает «мезоскопия с произвольным доступом»: система может быстро перемещать лазер в общем поле зрения. «На практике это означает, что я могу, скажем, перейти в моторную кору и записать выходные нейроны слоя, а затем перейти в другую область коры и одновременно получить изображение», — говорит Матис. Такие данные могут показать, как области мозга взаимодействуют и общаются, когда мыши играют в игру.

Но 2p-RAM не может сканировать эти области одновременно; при переходе лазера с места на место задержка составляет несколько миллисекунд. В разработках Хельмчена и Смита используются луч-разветвители, чтобы обеспечить эффективную одновременную съемку нескольких точек — этот процесс называется временным мультиплексированием. Смит и нейробиолог Джерри Чен, который был ведущим автором статьи Хельмчена и в настоящее время работает в Бостонском университете в штате Массачусетс, совместно работают над системой второго поколения, которая, по их словам, сможет получить доступ к четырем областям в пределах поля зрения размером 2p-RAM. Thorlabs, который уже установил более 25 мезоскопов в различных лабораториях, разрабатывает обновленную систему, способную одновременно получать изображения на разных глубинах, говорит Сэм Рубин, генеральный директор компании.

Диагональный подход

В Колумбийском университете в Нью-Йорке инженер-биомедик Элизабет Хиллман разработала способ применения световой микроскопии для непрозрачных образцов. В обычных световых микроскопах лазерный луч фокусируется собственной линзой объектива, которая перпендикулярна к объективу. Такое расположение ограничивает размер образца, который может вместить система, и исключает его применение для живых мышей.

Конструкция Хиллмана, названная SCAPE 2.0, решает этот вопрос, проецируя плоскость света под углом к ​​образцу и фиксируя полученную флуоресценцию с помощью той же линзы. Единственный движущийся элемент — это рулевое зеркало, и система может записывать объемы с невероятной скоростью при использовании в тандеме с быстрой камерой. «Мы успеваем сделать три измерения за то время пока микроскопы с точечным сканированием будут делать два», — говорит Хиллман.

Но световые лучи все еще не могут хорошо проникать в непрозрачные образцы. Поэтому, Хиллман в настоящее время разрабатывает двухфотонный вариант, который сможет измерять сотни микрометров в непрозрачных образцах, а также мезомасштабную версию для больших образцов.

Система также может быть применена к другой быстро растущей области микроскопии: визуализация больших, «очищенных» тканей, таких как мозг мыши, которые стали прозрачными благодаря химической обработке. Команда Хиллмана смогла изобразить кусок мозга мыши размером 8,4 × 9,1 × 0,4 мм3 всего за 4 минуты. Другие конструкции светового листа могут также визуализировать такие образцы. Один из них, называемый mesoSPIM, может отображать поле зрения в 21-мм; другой, разработанный физиком Рето Фиолкой из Юго-западного медицинского центра Университета Техаса в Далласе, и его коллегами, занимающиеся мозаикой полей миллиметрового размера для сбора образцов сантиметрового размера с субклеточным разрешением, Нейробиолог Раджу Томер, выпускник лаборатории Келлера и коллега Хиллмана из Колумбийского университета, разработал еще одну геометрию, называемую «тэта-микроскопия на световом листе», в которой объектив расположен под наклонным углом для устранения бокового ограничения свето-листовой микроскопии. Эта конструкция обеспечивает поле зрения в 1 мм, но может вместить образцы теоретически любой ширины.

По мере того как эти и другие проекты просачиваются через сообщество микроскопистов, откроются новые направления для исследований. Но, предупреждает Келлер, для достижения действительно широкого эффекта такие разработки должны сочетаться с более совершенной подготовкой и обработкой проб, простотой использования и доступностью. «Если целью является получение изображения большого образца с высоким разрешением, микроскоп может сделать это», — говорит он.

Nature 575, 715-717 (2019) doi: 10.1038/d41586-019-03632-y

Оригинал новости: https://www.nature.com/articles/d41586-019-03632-y